Отделение белков от низкомолекулярных примесей

Метод мембранных сит (диализ)

Используют диализную мембрану, которая является полимером и имеет поры определенной величины. Малые молекулы (низкомолекулярные примеси) проходят через поры в мембране, а крупные (белки) задерживаются. Таким образом белки отмывают от примесей.

Разделение белков по молекулярной массе

Гель-хроматография

Хроматографическую колонку заполняют гранулами геля (сефадекс), который имеет поры определенной величины. В колонку вносят смесь белков. Белки, размер которых меньше, чем размер пор сефадекса, задерживаются в колонке, так как «застревают» в порах, а остальные свободно выходят из колонки. Размер белка зависит от его молекулярной массы.

Ультрацентрифугирование

Этот метод основан на различной скорости седиментации (осаждения) белковых молекул в растворах с различным градиентом плотности (сахарозный буфер или хлорид цезия).

Электрофорез

Данный метод основан на различной скорости миграции белков и пептидов в электрическом поле в зависимости от заряда.

Носителями для электрофореза могут служить гели, ацетатцеллюлоза, агар. Разделяемые молекулы движутся в геле в зависимости от размера: те из них, которые имеют большие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, большие молекулы будут находиться ближе к старту, чем меньшие.

Методом электрофореза можно разделить белки по молекулярной массе. Для этого используют электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДS-Na).

ДДС-Na является дифильным веществом и содержит заряженную группу и гидрофобную. Белки связываются с ДДС-Na своими гидрофобными радикалами и при этом денатурируют. Таким образом, белки выравниваются по форме и заряду. После этого подвижность белка при электрофорезе зависит только от его молекулярной массы.

ПРЕДМЕТ БИОХИМИИ

Биохимия – наука о химических основах процессов жизнедеятельности, изучающая химические компоненты живых клеток, а также реакции и процессы, в которых они участвуют. Ее главной задачей является установление связи между молекулярной структурой и биологической функцией химических компонентов живых организмов.

Предметом медицинской биохимии являются химические процессы, происходящие в организме человека в норме и при патологии, диагностика и прогноз на основе биохимических исследований.

ХИМИЯ БЕЛКОВ

Белки - высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот, соединенных пептидными связями. Белки называют также протеинами (от греч. рrotos – первый). Свое название они получили, когда в тканях животных и растений были обнаружены вещества, имеющие сходство с белком куриного яйца.

Белки составляют основу и структуры, и функций живых организмов. Природные белки построены из 20 различных аминокислот. Эти аминокислоты могут объединяться в самой разной последовательности, поэтому они могут образовывать порядка 10 18 разнообразных белков. Они обеспечивают существование около 10 6 видов живых организмов, начиная от вирусов и заканчивая человеком. Каждый организм характеризуется уникальным набором белков.

Элементный состав белков в пересчете на сухое вещество: С - 50-54%; Н - 6,5-7,3%; О - 21-23%; N - 15-17%; S - до 0,5%.

В составе некоторых белков в небольших количествах содержатся фосфор, железо, марганец, магний, йод и др.

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ

Белки под действием различных факторов (действие химических реагентов, нагревание и др.) легко подвергаются денатурации - теряют некоторые нативные (природные) свойства, например, растворимость, биологическую активность. Поэтому для выделения белков разработаны специальные «щадящие» методы.

Процесс начинают с гомогенизации биологического материала – измельчения до разрушения клеточных структур. Для этого используют пестиковые или ножевых гомогенизаторы, шаровые мельницы, ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, метод «азотной бомбы».

Затем проводят экстракцию белков буферными смесями с определенными значениями рН, органическими растворителями. Большинство белков хорошо растворимо в 8-10% растворах солей.

Для фракционирования и очистки белков используют следующие методы.

Высаливание – осаждение белков из раствора при добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов. Этот метод используется в клинической практике при анализе белков сыворотки крови, например, для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении раствора сульфата аммония) и альбуминов (при 100% насыщении).

Электрофорез основан на различии в скорости движения белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора. Применяется в клинической медицине для анализа белковых и пептидных смесей, сыворотки крови.

Ультрацентрифугирование - метод разделения жидких дисперсных сред на компоненты под действием центробежной силы.

Хроматография (от греч. chroma – цвет) - физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении их компонентов между двумя несмешивающимися фазами – неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент).

Различают следующие разновидности хроматографии:

- адсорбционная - разделение компонентов смеси основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте;

- распределительная - твердая фаза служит опорой для стационарной жидкой фазы. Разновидностью является хроматография на бумаге;

- ионообменная - используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются с колонки;

- гель-хроматография , или метод молекулярных сит, основан на способности небольших молекул проникать в поры геля, тогда как большие молекулы остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки. Позволяет разделить белки с разной молекулярной массой.

Перспективными видами хроматографииявляются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и газовая хроматография . Хроматография является одним из основных методов биохимических исследований. В клинических лабораториях ее применяют для разделения и анализа аминокислот, белков, углеводов, фосфолипидов, стероидов в плазме крови, тканевых экстрактах, моче.

ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

Каталитическая функция. Большинство известных в настоящее время ферментов, называемых биологическими катализаторами, является белками. К настоящему времени охарактеризованы несколько тысяч ферментов.

Транспортная функция. Дыхательная функция крови, в частности перенос кислорода, осуществляется молекулами гемоглобина-белка эритроцитов. В транспорте липидов принимают участие альбумины сыворотки крови.

Защитная функция. В ответ на поступление в организм бактерий, токсинов, вирусов или чужеродных белков синтезируются защитные белков-антител (иммунная защита). Ряд белков плазмы крови способны к свертыванию, что предохраняет от кровопотери при ранениях (физическая защита).

Гормональная функция. Ряд гормонов представлен белками или полипептидами, например, гормон поджелудочной железы инсулин.

Структурная функция. В комплексе с липидами белки участвуют в образовании биомембран клеток. Структурные белки цитоскелета придают форму клеткам и многим органоидам. Структурные белки - коллаген в соединительной ткани, кератин в волосах, ногтях, коже, эластин в сосудистой стенке и др.

Питательная (резервная) функция. Белки яйца (овальбумины) являющиеся источниками питания для плода. Основной белок молока (казеин) также выполняет питательную функцию.

Рецепторная функция. Белковые рецепторы встраиваются в клеточную мембрану или находятся в цитоплазме. Рецептор воспринимает сигнал, которым чаще всего служит химическое вещество.

Сократительная (двигательная) функция. Сократительная функция присуща мышечным белкам (актин и миозин), белкам цитоскелета, что обеспечивает расхождение хромосом в процессе митоза.

Другие важные функции белков - способность поддерживать онкотическое давление в клетках и крови, буферные свойства, поддерживающие физиологическое значение рН внутренней среды, и др.

Особенности строения и функционирования организма зависят от набора белков, синтезирующихся в нем. Изучение строения и свойств белков невозможно без их выделения из клетки и очистки от других белков и органических молекул. Стадии выделения и очистки индивидуальных белков:

1 Разрушение клеток изучаемой ткани и получение гомогената.

2 Разделение гомогената на фракции центрифугированием, получение ядерной, митохондриальной, цитозольной или иной фракции, содержащей искомый белок.

3 Избирательная тепловая денатурация - кратковременное нагревание раствора белков, при котором можно удалить часть денатурированных белковых примесей (в том случае, если белок относительно термостабилен).

4 Высаливание. Различные белки выпадают в осадок при разной концентрации соли в растворе. Постепенно повышая ее концентрацию, можно получить ряд отдельных фракций с преимущественным содержанием выделяемого белка в одной из них. Наиболее часто для фракционирования белков используют сульфат аммония. Белки с наименьшей растворимостью выпадают в осадок при небольшой концентрации солей.

5 Гель-фильтрация - метод молекулярного просеивания молекул через набухшие гранулы сефадекса (трехмерные полисахаридные цепи декстрана, имеющие поры). Скорость прохождения белков через колонку, заполненную сефадексом, будет зависеть от их молекулярной массы: чем меньше масса молекул, тем легче они проникают внутрь гранул и дольше там задерживаются, чем больше масса, тем быстрее они элюируются с колонки.

6 Ультрацентрифугирование - метод, заключающийся в том, что белки в центрифужной пробирке помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора скорость оседания белков пропорциональна их молекулярной массе: более тяжелые белки образуют фракции, расположенные ближе ко дну кюветы, более легкие - к поверхности.

7 Электрофорез - метод, в основе которого лежат различия в скорости движения белков в электрическом поле. Эта величина пропорциональна заряду белков. Электрофорез белков проводят на бумаге (где скорость движения белков пропорциональна только их заряду) или в полиакриламидном геле, имеющем определенную величину пор (скорость движения белков пропорциональна их заряду и молекулярной массе).

8 Ионообменная хроматография - метод фракционирования, основанный на связывании ионизированных групп белков с противоположно заряженными группами ионообменных нерастворимых полимеров. Прочность связывания белка со смолой пропорциональна заряду белка. Белки, адсорбированные на ионообменном полимере, можно смыть возрастающими концентрациями NaСl; чем меньше заряд белка, тем меньшая концентрация NaСl потребуется, чтобы смыть белок, прикрепленный к ионогенным группам смолы.

9 Аффинная хроматография - наиболее специфический метод выделения индивидуальных белков. К инертному полимеру ковалентно присоединяется лиганд какого-либо белка. При пропускании раствора белков через колонку с полимером за счет комплементарного связывания белка с лигандом на колонке адсорбируется только специфичный для данного лиганда белок.

10 Для удаления низкомолекулярных соединений из раствора выделяемого белка применяют диализ. Метод основан на неспособности белков проходить через полупроницаемую мембрану, легко пропускающую низкомолекулярные вещества, в частности соли. Применяется для очистки белков от низкомолекулярных примесей, например от солей после высаливания.

Задания

1 Определите суммарный заряд пентапептида при рН 7,0:

Глу-Арг-Лиз-Вал-Асп

Как изменится суммарный заряд этого пептида:

а) при рН<7,0;

б) при рН >7,0?

2 Определите ИЭТ пептидов (>, < или =7,0):

а) Про-Лиз-Тир-Глн-Три;

б) Ала-Сер-Глу-Асн-Мет.

3 Сравните направление движения в электрическом поле двух пептидов при рН 7,0 (к катоду или аноду):

а) Вал-Глу-Ала;

б) Лей-Асн-Арг.

4 Сравните растворимость двух пептидов при рН 7,0:

Сер-Цис-Глу-Тир-Асп;

Вал-Арг-Мет-Фен-Тир.

5 В ядерных белках-гистонах содержится большое количество аминокислотных остатков аргинина и лизина, а в белке крови альбумине – много остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот. Ответьте на вопросы:

а) в каких средах (>, < или =7,0) лежит ИЭТ этих белков?

б) с каким из двух белков может взаимодействовать Са 2+ ?

6 Подберите к пронумерованному методу разделения и очистки белков их соответствующие свойства, на которых основан данный метод:

А) Различия по величине заряда.

Б) Различия по молекулярной массе.

Г) Ни один.

1 Гель-фильтрация.

2 Электрофорез в полиакриламидном геле.

3 Аффинная хроматография.

4 Ионообменная хроматография.

А) Ультрацентрифугирование.

Б) Гель-фильтрация.

В) Электрофорез в полиакриламидном геле.

Г) Ионообменная хроматография.

Д) Аффинная хроматография.

1 Используется для отделения белка от соли.

2 Метод основан на присоединении белка к иммобилизованному лиганду.

3 В основе метода лежит использование различий в молекулярной массе и заряде белков.

8 Выберите методы, с помощью которых можно разделить смесь белков на индивидуальные белки; укажите физико-химические свойства белков, лежащие в основе каждого метода.

9 Как суммарный заряд белка влияет на его растворимость:

а) определите суммарный заряд пептида при рН 7,0

Ала-Глу-Тре-Про-Асп-Лиз-Цис;

б) как изменится заряд этого пептида при рН >7,0, рН<7,0, рН<<7,0?

в) что такое изоэлектрическая точка (ИЭТ) белка и в какой среде лежит ИЭТ данного пептида?

г) при каком значении рН будет наблюдаться наименьшая растворимость данного пептида?

10 Почему кислое молоко в отличие от свежего при кипячении сворачивается (т.е. белок молока казеин выпадает в осадок)? В свежем молоке молекулы казеина имеют отрицательный заряд.

11 Решите задачу.Смесь, содержащую белки А, В и С с молекулярной массой соответственно 160 000, 80 000 и 60 000 Д, анализировали методом гель-фильтрации. Гранулы набухшего геля проницаемы для белков с мол. массой менее 70 000 Д. Укажите возможные варианты порядка выхода белков А, В и С из колонки.

12 Сравните использование метода диализа и гель-фильтрации:

1 Метод используется для очистки белков от низкомолекулярных соединений.

2 Метод используется для фракционирования высокомолекулярных веществ по различию молекулярной массы.

3 Метод используется для разделения белков по суммарному заряду.

4 Метод используется для определения молекулярной массы.

А) Характерно для диализа.

Б) Характерно для гель-фильтрации.

В) Характерно для обоих методов.

Г) Нехарактерно ни для одного из них.

5.3 Контрольные вопросы

1 От чего зависит растворимость белков?

2 Опишите этапы выделения и очистки белков. Что такое лиофилизация?

3 Молекулярная масса белков и методы ее определения.

4 Амфотерные свойства белков. Изоэлектрическая точка.

Список используемой литературы

1 Биохимия // под ред. Е.С.Северина, А.Я.Николаева. – М: ГЭОТАЗ-МЕД. 2001. – 449с.

2 Пластинина З.А., Жамсаранова С.Д. Методические указания для самостоятельной подготовки к лабораторным занятиям по биологической химии. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2003. - 109 с.

3 Филиппович Ю.Б. Биохимия белка и нуклеиновых кислот. - М.: Просвещение. 1978. - 203 с.

4 Анисимов А.А. и др. Основы биохимии. - М.: Высш. шк., 1985. - 398с.

5 Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. - М.: Просвещение, 1982. - 157 с.

6 Остроумов С.А. Введение в биохимическую экологию. - М.: Мир, 1986. -

7 Уильямс Б., Уилсон К. Методы практической биохимии. - М.:Мир, 1978. - 268 с.

Контрольная работа по теме:
«Происхождение жизни на Земле»

Вариант 1

Часть А

1.

б) наличием катализаторов;

г) обменными процессами.

2.

а) анаэробные гетеротрофы;
б) аэробные гетеротрофы;
в) автотрофы;
г) организмы-симбионты.

3. К такому общему свойству живого, как саморегуляция, относится:

а) наследственность;
б) изменчивость;
в) раздражимость;
г) онтогенез.

4. Сущность теории абиогенеза состоит в:

в) сотворении мира Богом;

5. Кристалл не является живой системой, т.к.:

а) он не способен к росту;

в) ему не свойственна раздражимость;

6. Опыты Луи Пастера доказали возможность:

а) самозарождения жизни;


г) биохимической эволюции.

7.

а) радиоактивность;
б) наличие жидкой воды;
в) наличие газообразного кислорода;
г) масса планеты.

8. Углерод является основой жизни на Земле, т.к. он:

9. Исключите лишнее:

а) 1668 г.;
б) Ф.Реди;
в) мясо;
г) бактерии.

10.

а) Л.Пастер;
б) А.Левенгук;
в) Л.Спалланцани;
г) Ф.Реди.

Часть Б

Закончите предложения.

1. Теория, постулирующая сотворение мира Богом (Творцом), – … .

2. Доядерные организмы, не имеющие ограниченного оболочкой ядра и органоидов, способных к самовоспроизведению, – … .

3. Фазовообособленная система, взаимодействующая с внешней средой по типу открытой системы, – … .

4. Советский ученый, предложивший коацерватную теорию происхождения жизни, – … .

5. Процесс, в результате которого организм приобретает новую комбинацию генов, – … .

Часть В

Дайте краткие ответы на следующие вопросы.

1. Каковы общие признаки живой и неживой материи?

2. Почему при возникновении первых живых организмов в атмосфере Земли должен был отсутствовать кислород?

3. В чем состоял опыт Стенли Миллера? Что соответствовало «первичному океану» в этом опыте?

4. В чем заключается основная проблема перехода от химической эволюции к биологической?

5. Перечислите основные положения теории А.И. Опарина.

Вариант 2

Часть А

Выпишите номера вопросов, рядом с ними запишите буквы правильных ответов.

1. Живое отличается от неживого:

а) составом неорганических соединений;

в) взаимодействием молекул друг с другом;
г) обменными процессами.

2. Первыми живыми организмами на нашей планете были:

а) анаэробные гетеротрофы;
б) аэробные гетеротрофы;
в) автотрофы;
г) организмы-симбионты.

3.

а) метаболизм;
б) репродукция;
в) раздражимость;
г) онтогенез.

4. Сущность теории биогенеза состоит в:

а) происхождении живого из неживого;
б) происхождении живого от живого;
в) сотворении мира Богом;
г) занесении жизни из Космоса.

5. Звезда не является живой системой, т.к.:

а) она не способна к росту;

в) она не обладает раздражимостью;

6.

а) самозарождения жизни;
б) появления живого только из живого;
в) занесения «семян жизни» из Космоса;
г) биохимической эволюции.

7. Из перечисленных условий наиболее важным для возникновения жизни является:

а) радиоактивность;
б) наличие воды;
в) наличие источника энергии;
г) масса планеты.

8. Вода является основой жизни, т.к.:

а) является хорошим растворителем;


г) обладает всеми перечисленными свойствами.

9. Исключите лишнее:

а) 1924 г.;
б) Л.Пастер;
в) мясной бульон;
г) бактерии.

10. Расположите в логической последовательности следующие имена:

а) Л.Пастер;
б) С.Миллер;
в) Дж.Холдейн;
г) А.И. Опарин.

Часть Б

Закончите предложения.

1. Процесс образования живыми организмами органических молекул из неорганических за счет энергии солнечного света – … .

2. Доклеточные образования, обладавшие некоторыми свойствами клеток (способность к обмену веществ, самовоспроизведению и т.п.), – … .

3. Разделение раствора белков, содержащего и другие органические вещества, на фазы с большей или меньшей концентрацией молекул – … .

4. Английский физик, предположивший, что адсорбция была одним из этапов концентрирования органических веществ в ходе предбиологической эволюции – … .

5. Свойственная всем живым организмам система записи наследственной информации в молекулах ДНК в виде последовательности нуклеотидов – … .

Часть В

1. В чем состоял опыт Стенли Миллера? Что соответствовало «молниям» в этом опыте?

2. Почему масса планеты, на которой может возникнуть жизнь, не должна быть больше 1/20 массы Солнца?

3. К какой стадии развития жизни на Земле можно отнести слова гоголевского героя: «Числа не помню. Месяца тоже не было. Было черт знает что такое»?

4. Какие условия необходимы для возникновения жизни?

5. Что такое панспермия? Кто из известных вам ученых придерживался этой теории?

Вариант 3

Часть А

Выпишите номера вопросов, рядом с ними запишите буквы правильных ответов.

1. Живое отличается от неживого:

а) составом неорганических соединений;
б) способностью к самовоспроизведению;
в) взаимодействием молекул друг с другом;
г) обменными процессами.

2. Первыми живыми организмами на нашей планете были:

а) анаэробные гетеротрофы;
б) аэробные гетеротрофы;
в) автотрофы;
г) организмы-симбионты.

3. К такому общему свойству живого как, самообновление, относится:

а) метаболизм;
б) репродукция;
в) раздражимость;
г) онтогенез.

4. Сущность креационизма состоит в:

а) происхождении живого из неживого;
б) происхождении живого от живого;
в) сотворении мира Богом;
г) занесении жизни из Космоса.

5. Река не является живой системой т.к.:

а) она не способна к росту;
б) она не способна к размножению;
в) она не способна к раздражимости;
г) не все свойства живого ей присущи.

6. Опыт Франческо Реди доказал невозможность:

а) самозарождения жизни;
б) появления живого только из живого;
в) занесения «семян жизни» из космоса;
г) биохимической эволюции.

7. Из перечисленных условий наиболее важным для возникновения жизни является:

а) радиоактивность;
б) наличие воды;
в) безгранично долгое время эволюции;

8. В период возникновения жизни в атмосфере Земли должен был отсутствовать кислород, т.к.:

а) он является активным окислителем;
б) обладает высокой теплоемкостью;
в) увеличивает свой объем при замерзании;
г) все вышеперечисленное в комплексе.

9. Исключите лишнее:

а) 1953 г.;
б) бактерии;
в) С.Миллер;
г) абиогенный синтез.

10. Расположите в логической последовательности следующие фамилии:

а) Л.Пастер;
б) Ф.Реди;
в) Л.Спалланцани;
г) А.И. Опарин.

Часть Б

Закончите предложения.

1. Образование органических молекул из неорганических вне живых организмов – … .

2. Пузырьки жидкости, окруженные белковыми пленками, возникающие при взбалтывании водных растворов белков, – … .

3. Способность воспроизводить себе подобные биологические системы, которая проявляется на всех уровнях организации живой материи, – … .

4. Американский ученый, предложивший термическую теорию происхождения протобиополимеров, – … .

5. Белковые молекулы, ускоряющие течение биохимических превращений в водных растворах при атмосферном давлении, – … .

Часть В

Дайте краткий ответ на поставленный вопрос.

1. В чем основное отличие горения дров от «горения» глюкозы в клетках?

2. Каковы три современные точки зрения на проблему происхождения жизни?

3. Почему именно углерод является основой жизни?

4. В чем состоял опыт Стенли Миллера?

5. Каковы основные этапы химической эволюции?

Вариант 4

Часть А

Выпишите номера вопросов, рядом с ними запишите буквы правильных ответов.

1. Живое отличается от неживого:

а) составом неорганических соединений;
б) способностью к саморегуляции;
в) взаимодействием молекул друг с другом;
г) обменными процессами.

2. Первыми живыми организмами на нашей планете были:

а) анаэробные гетеротрофы;
б) аэробные гетеротрофы;
в) автотрофы;
г) организмы-симбионты.

3. К такому общему свойству живого, как самовоспроизведение, относится:

а) метаболизм;
б) репродукция;
в) раздражимость;
г) онтогенез.

4. Сущность теории панспермии состоит в:

а) происхождении живого из неживого;
б) происхождении живого от живого;
в) сотворении мира Богом;
г) занесении на Землю «семян жизни» из Космоса.

5. Ледник не является живой системой т.к.:

а) он не способен к росту;
б) он не способен к размножению;
в) он не способен к раздражимости;
г) не все свойства живого ему присущи.

6. Опыт Л.Спалланцани доказал невозможность:

а) самозарождения жизни;
б) появления живого только из живого;
в) занесения «семян жизни» из Космоса;
г) биохимической эволюции.

7. Из перечисленных условий наиболее важным для возникновения жизни является:

а) радиоактивность;
б) наличие воды;
в) наличие определенных веществ;
г) определенная масса планеты.

8. Углерод является основой жизни, т.к. он:

а) является самым распространенным на Земле элементом;
б) первым из химических элементов стал взаимодействовать с водой;
в) имеет небольшой атомный вес;
г) способен образовывать устойчивые соединения с двойными и тройными связями.

Продолжение следует

Диализом называется процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупронецаемых мембран. Белковые молекулы, обладая большой молекулярной массой, не способны проникать через полупронецаемые перегородки (искусственные и естественные мембраны). При этом низкомолекулярные частицы (органические и неорганические) легко проходят через поры полупроницаемых мембран.

Диализ широко используется для очистки белков от низкомолекулярных примесей (соли, сахара и других), которые легко проходят через поры полупроницаемых мембран. Прибор, в котором проводят диализ, называется диализатором. Целлофановый или коллодиевый мешочек, опущенный в сосуд с водой, представляет простейший диализатор (рис.1). Белок, помещенный в мешочек, остается в нем, а низкомолекулярные вещества диффундируют через мембрану в воду.

Методом диализа можно разделить альбумины и глобулины. При переходе солей из белкового раствора в окружающую среду глобулины будут выпадать в осадок, т.к. они не растворимы в водной среде, а альбумины будут оставаться в растворе. Простейшим диализатором может служить целлофановый мешочек, опущенный в стакан с водой. Солевой раствор белка помещают в мешочек, при этом молекулы низкомолекулярных веществ (ионы соли) диффундируют через стенку мешочка, а крупные молекулы белка остаются внутри мешочка.

2 NН 4 + SО 4 2-

Рисунок 1- Схема диализатора

Ход работы. 10–15 мл раствора яичного белка, содержащего альбумины, глобулины и сульфат аммония, помещают в целлофановый мешочек и погружают в стакан с дистиллированной водой так, чтобы уровень жидкости в мешочке совпадал с уровнем воды. Для ускорения диализа необходимо менять воду в сосуде. Через 1 час анализируют воду из стакана: в одной пробирке проводят биуретовую реакцию и убеждаются, что белки через мембрану не проходят; в другой пробирке проводят реакцию на ион SO 4 2- , добавлением нескольких капель 10%-ного раствора ВаСI 2 для установления проникновения соли через стенку целлофанового мешочка. Через 2–3 часа отмечают появление осадка глобулинов внутри мешочка, который отфильтровывают. В фильтрате остаются белки альбуминовой фракции.

Глобулиновую природу белков осадка доказывают растворением его в растворах солей (10%-ный раствор хлористого аммония, хлористого натрия и др.) При разбавлении раствора водой вновь выпадает осадок.

Альбуминовую природу белков фильтрата подтверждают разбавлением водой с отсутствием осадка или полным насыщением сернокислым аммонием (выпадает осадок).

Материалы и реактивы: раствор яичного белка, содержащего альбумины, глобулины и сульфат аммония (см. приложение Б, п.5); 10%-ный раствор хлористого бария; 10%-ный раствор едкого натра; 1%-ный раствор медного купороса; 10%-ный раствор хлористого аммония; сернокислый аммоний, тонко измельченный.

Оборудование: пробирки обыкновенные; целлофановый или коллодиевый мешочек; химический стакан или сосуд на 1–2 мл; пипетки мерные на 10 мл; пипетки.

Контрольные вопросы

1. Принцип процесса диализа.

2. Устройство простейшего диализатора.

3. Для каких целей применяется диализ?

4. Почему методом диализа можно отделить глобулины (солерастворимые белки) от глобулинов (водорастворимые белки)?

5. Как доказать глобулиновую и альбуминовую природу белков при их разделении?